器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計(jì)、磁力攪拌器。

具體步驟：

（一）水的制備

細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水

（二）PBS的制備與消毒(也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4-H2O 1.56 g，KH2PO4 0. 2 g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動(dòng)，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000 ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。

2.移入溶液瓶?jī)?nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補(bǔ)充蒸發(fā)掉的水份。

（三）胰蛋白酶溶液的配制與消毒

胰蛋白酶的作用是使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對(duì)胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時(shí)間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37℃時(shí)，胰酶溶液的作用能力很強(qiáng)。使用胰酶時(shí)，應(yīng)把握好濃度、溫度和時(shí)間，以免消化過(guò)度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時(shí)應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。終止消化時(shí)，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對(duì)細(xì)胞的作用。

1.稱(chēng)取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25%，用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調(diào)PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過(guò)夜。

2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超凈臺(tái)內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成小瓶于-20℃保存以備使用。

（四）青、鏈霉素溶液的配制于消毒

1.所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。

2.具體操作均在超凈臺(tái)內(nèi)完成。青霉素是80萬(wàn)單位/瓶，用注射器加4 ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬(wàn)單位/瓶，加5 ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬(wàn)單位。

3.使用時(shí)溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克

（五）RPMI1640的制備與消毒

1.溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中)，充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙猓凑瞻b說(shuō)明添加一定的藥品。然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配制好的青鏈霉素液各0.5 ml，使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。然后用一個(gè)當(dāng)量的鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2左右。最后定容至1000 ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時(shí)先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3.抽濾：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過(guò)濾除菌。通常用蔡式濾器在超凈工作臺(tái)內(nèi)過(guò)濾。

4.分裝：將過(guò)濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶?jī)?nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。

5.使用前要向100 ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃時(shí)兩周有效）。

（六）血清的滅活

細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買(mǎi)來(lái)的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過(guò)抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。

（七）HEPES溶液

HEPES的化學(xué)全稱(chēng)位羥yi基呱嗪乙硫磺酸（N’
-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長(zhǎng)時(shí)間控制恒定的pH范圍。使用終濃度為10-50 mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20 mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。

1 mol/L HEPE緩沖液配制方法如下：準(zhǔn)確稱(chēng)取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過(guò)濾除菌，分裝后4℃保存。注意：因?yàn)楝F(xiàn)在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據(jù)實(shí)際情況靈活配制，但是要保證培養(yǎng)液內(nèi)HEPES的終濃度仍然為20 mmol/L 。如：稱(chēng)取4.766克HEPES溶于20 ml三蒸水中，過(guò)濾除菌后可*（20 ml）加入1 L培養(yǎng)液中，或者每100 ml培養(yǎng)液中加入2 ml即可。

（八）谷氨酰胺

合成培養(yǎng)基中都含有較大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，細(xì)胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白質(zhì)，谷氨酰胺缺乏要導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)不良甚至死亡。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補(bǔ)加一定量的谷氨酰胺。由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，4℃下放置1周可分解50％，故應(yīng)單獨(dú)配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，應(yīng)重新加入原來(lái)的谷氨酰胺。一般培養(yǎng)液中谷氨酰胺的含量為1～4 mmol/L。可以配制200 mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時(shí)加入培養(yǎng)液。配制方法為，谷氨酰胺2.922 g溶于三蒸水加至100 ml即配成200 mmol/L的溶液，充分?jǐn)嚢枞芙夂螅^(guò)濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時(shí)可向100ml培養(yǎng)液中加入1 ml谷氨酰胺溶液。

（九）肝素溶液的配制

含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml。因?yàn)楝F(xiàn)在市售的多為肝素鈉，包裝為約為0.56克/瓶，配制時(shí)，可將其溶于100ml三蒸水中，定容，過(guò)夜，然后過(guò)濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為℃。使用時(shí)，向100ml培養(yǎng)液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。

（十）Ⅰ型膠原酶

0.1%Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。注意：因?yàn)棰裥湍z原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過(guò)濾，因此可以用蔡式濾器過(guò)濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

（十一）明膠溶液

因?yàn)槊髂z難于過(guò)濾，所以配制0.1%明膠溶液必須用無(wú)菌的PBS配制。所以制備過(guò)程中必須要注意無(wú)菌操作。首要的問(wèn)題是如何無(wú)菌準(zhǔn)確稱(chēng)量0.1克（配成100ml溶液）-即解決無(wú)菌分裝藥品的問(wèn)題。其次要注意即使是0.1的溶液，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過(guò)夜放置，然后無(wú)菌分裝入50ml小瓶中， 4℃保存。

（十二）其他培養(yǎng)用液的配制：

20ug/ml內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

注意事項(xiàng)：

1.配制溶液時(shí)必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時(shí)通常使用孔徑0.45微米 和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位于0.22微米的濾膜上方，并且要特別注意濾膜光面朝上。

3.配制RPMI1640培養(yǎng)基時(shí)因?yàn)檫€要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養(yǎng)液PH值最終為7.2，可在配制時(shí)調(diào)PH至7.4。

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，支原體感染發(fā)生率達(dá)到63%，因而細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中被支原體污染是一個(gè)世界性的難題。細(xì)胞培養(yǎng)中常遇見(jiàn)的有細(xì)菌污染、真菌污染、支原體污染、病毒污染等。說(shuō)起支原體污染，估計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)就開(kāi)始犯愁了，細(xì)胞培養(yǎng)的老手都知道，支原體污染非常不易察覺(jué)。有的實(shí)驗(yàn)室被支原體污染后，如果不進(jìn)行有效*的支原體清除，該實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)很難進(jìn)行下去，細(xì)胞傳代3代以后狀態(tài)就急劇下滑，無(wú)法進(jìn)行正常實(shí)驗(yàn)，有的實(shí)驗(yàn)室甚至只能指望換細(xì)胞間。那么怎樣才能有效檢測(cè)并清除支原體污染呢?

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注：如果沒(méi)有擦拭干凈，液體揮發(fā)后表面可能有白色殘留，影響美觀。此時(shí)可用噴壺噴灑蒸餾水到白色殘留處，然后擦拭即可。

針對(duì)移液器需要去除DNA污染，可按照說(shuō)明書(shū)拆開(kāi)移液器，將桿軸浸泡在PCR Clean™噴霧劑中，1分鐘后取出后用水沖洗，晾干，重新組合。