細胞培養(yǎng)注意事項

1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺(laminar flow) 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70 %ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70 % ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。

2. 無菌操作工作區(qū)域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70 % ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。

3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45° 角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。

4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當?shù)燃壷疅o菌操作臺(至少Class II)。操作過程中，應避免引起aerosol 之產(chǎn)生，，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。

5. 定期檢測下列項目：5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力5.2. CO2 培養(yǎng)箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3. 無菌操作臺內之a(chǎn)irflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網(wǎng)(300小時/預濾網(wǎng)，3000 小時/HEPA)。

6. 水槽可添加消毒劑(Zephrin 1:750)，定期更換水槽的水

現(xiàn)在做細胞培養(yǎng)實驗的實驗室越來越多，如果打算開展或者已經(jīng)開展的單位或者實驗室更要做到以下幾點。

 

1、選擇正確的培養(yǎng)基

在養(yǎng)細胞之前，就要了解，你所養(yǎng)細胞的來源以及種類和名稱，查閱一定量的文獻，確定所需培養(yǎng)液種類以及是否需要添加特殊成分，常用的細胞培養(yǎng)液有DMEM、RPMI1640、F12等等，一些常見的細胞基本可以使用這幾種培養(yǎng)基中的一種來培養(yǎng)，有的需要加入一定其他成分，這需要根據(jù)不同的細胞類型，查ATCC細胞庫或者查文獻，才能找到所需最佳培養(yǎng)液。選擇正確的培養(yǎng)液是養(yǎng)好細胞的第一步。

2、了解細胞的生長習性

不同的細胞生長習性不同。如成纖維細胞是貼壁生長，有一定的密度依賴性，密度小可能會出現(xiàn)不增殖，狀態(tài)差的情況，接種密度大時則需要隔天傳代，頻繁傳代則影響細胞狀態(tài)；再如RPMI-8226人多發(fā)性骨髓瘤細胞，是懸浮生長的，傳代需離心棄去上清即可。總之，了解細胞生長習性，再加上正確的計數(shù)，才能掌握好傳代的密度。

3、選擇優(yōu)質的血清

血清中含有細胞生長所必須的生長因子，作為哺乳動物細胞培養(yǎng)的附加物，血清的添加是十分重要的，因此，選擇優(yōu)質的血清，是細胞養(yǎng)殖成功與否的關鍵！

4、及時傳代和更換培養(yǎng)液

在細胞增殖到一定的密度后，要及時傳代，根據(jù)細胞的生長速度和密度，及時更換培養(yǎng)液。更換過勤，浪費培養(yǎng)液，更換不夠及時，則細胞狀態(tài)轉差，一般需隔天更換培養(yǎng)液，具體可根據(jù)所養(yǎng)細胞種類予以調整。

5、絕對的無菌意識

前面林林總總全部都注意好了，如果無菌意識差，細胞中混入了微生物，則千里之堤潰于蟻穴，細菌的生長速度和破壞力，將迅速占領培養(yǎng)皿，破壞細胞結構，有些初學者會在培養(yǎng)液中加入1%的雙抗，但是，無菌意識不強，雙抗亦無法拯救你的細胞！

6、傾心的呵護，頻繁的觀察

做到以上幾點，就可以開始養(yǎng)你的細胞了，但是再次重申細胞嬌弱，在養(yǎng)細胞的過程中，難免會出現(xiàn)一些意想不到的問題，要想成功養(yǎng)好細胞，時時惦記它
，頻繁地觀察，初期一天觀察2次都不足為過，出現(xiàn)任何預料外的情況，及時處理，才能保障收獲一盤“漂亮”的細胞。