在我國，微生物法測定食品中的維生素B12、葉酸、泛酸、煙酸、生物素是首要方法方法，因此在國民生計中起到重要作用。本文擬以維生素B12為例，從方法學的角度就微生物法的特點，作一文獻上的綜述。

1954年，微生物法測定乳品中的維生素B12出現(xiàn)，是由英國國立奶業(yè)研究所、維生素B12的研究專家Margaret E. Gregory首先建立，她用該法測定來自不同動物種屬的奶中的維生素B12的含量（1）。

微生物法測定乳品和食品中的維生素B12，在上世紀90年代引入我國。關于這一方法，已有多篇報道進行了方法學上的探討?，F(xiàn)總結(jié)如下：

（一）對微生物法的評估

上海市食品藥品檢驗所蔣孟虹等人用微生物法測定了腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑中的維生素B12 含量。她們認為，液相色譜法僅適用于常量分析,維生素B12對色譜前處理要求高, 因此色譜很難滿足痕量測定的要求。但微生物法操作步驟較多, 一些因素可能影響測定結(jié)果的準確性。因此，她們對影響因素進行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：

Ø測試菌液的透光率在60%～80%之間時, 標準曲線的線性擬合較好，過高過低均導致線性擬合差。

Ø當測試菌液的加入量為50μL時, 標準曲線線性擬合良好。過多易導致濁度過高而不成梯度。

Ø標準曲線高濃度點的透光率在30%左右為測定時間, 此時各濃度點的透光率差別較大, 可拉開梯度。

Ø維生素B12 在0.001～0.010 ng/mL 濃度范圍內(nèi)線性關系良好。

她們認為，微生物法檢出限低、靈敏度高,測定結(jié)果準確可靠, 適用于微量維生素B12的含量測定, 值得經(jīng)常進行維生素檢測的實驗室應用推廣（2）。

國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心的張玉杰等人提出：微生物法的好處是，測定的是維生素的生物活性含量，更具生物學意義。同時，微生物作為一種活試劑，具有自身的特異性和高度的靈敏性，使得測定結(jié)果更為準確。微生物分析法測定VB12在上已有幾十年的歷史，只是在我國報導還不是很多。

他們采用微生物法對12個奶基嬰幼兒食品的VB12含量進行了多次重復測定，發(fā)現(xiàn)相對誤差均在10%以內(nèi)，50%的樣品測定的誤差小于5%，回收率多在90-110%之間。因而該方法是可行的，結(jié)果也是準確可靠的（3）。

廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院林耀文等人發(fā)現(xiàn)，微生物法測定含乳飲料中的維生素B12，重復性良好，線性相關系數(shù)大于0.99，平均回收率為91.20%～102.2%，檢出限為0.04ng/ml，具有簡便、快速、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點。（5）

（二）微生物法的干擾因素和注意事項

國家乳制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心的張玉杰等人提出了幾點注意事項：

*，有些細菌可以產(chǎn)生Vb12，因此所有玻璃器皿及用具都要嚴格清洗，嚴格滅菌。清洗后放入250℃烘箱，加熱1-2小時。整個分析過程都要注意防止溶液過多地暴露于光線中。

第二，建議每個梯度標準溶液設三個平行檢驗管，減少誤差。所有檢驗管滅菌后要迅速水冷卻，盡量避免顏色形成。冷卻速度要一樣。

第三，測定菌體濃度時，要等檢驗管內(nèi)發(fā)育和繁殖過程*停止后再進行。（3）

湖北省宜昌市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所陳緒華等人觀察了測定培養(yǎng)基的不同品牌對維生素B12線性的影響。發(fā)現(xiàn)青島海博和北京陸橋的維生素B12測定培養(yǎng)基作出的線性結(jié)果不理想，主要是培養(yǎng)基所含的本底較高。而更換為BD的測定培養(yǎng)基后，所得的線性結(jié)果較理想。本底存在，會導致目標物質(zhì)的促生長作用減弱（即吸光度沒有等量增加）。當測定培養(yǎng)基中不含本底時，菌懸液以及培養(yǎng)時間的微弱變化只影響標準曲線的生長量，不影響曲線的線性。（4）

據(jù)我們了解，目前BD的維生素B12測定培養(yǎng)基已停產(chǎn)，因此可選用的微生物生產(chǎn)商HiMedia的產(chǎn)品。

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院王志偉等人強調(diào)，菌種的活力和純度對實驗結(jié)果有非常大的影響，應嚴格按照要求進行菌種純化（7）。

（三）對標準微生物法的改進

廣州市質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院吳環(huán)等人提出了幾個更簡便的操作技巧用于維生素B12的測定：一是試驗體系的體積縮小。用1.2ｍlPP小管替代了傳統(tǒng)的試管進行標準曲線溶液及樣品溶液的培養(yǎng)和測定；標準曲線溶液和樣品溶液的制備也在1.2mlPP小管中進行，由此避免了大量玻璃器皿的使用，同時顯著降低了外部干擾；二是將試驗菌株預先固定在96排管，利用甘油保護冷凍的菌種。具體操作為：將萊士曼氏乳酸桿菌凍干菌株活化后，接種到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，（36.0±1.0）℃培養(yǎng)18～24h，將增菌肉湯培養(yǎng)物3000r/min離心數(shù)次，棄去上清液，使用含有甘油的維生素B12測定培養(yǎng)基進行適宜的稀釋后，將菌懸液加入1.2ｍlPP小管中，-80℃凍存?zhèn)溆?。該方法極大地縮短了試驗周期，而且菌株活力穩(wěn)定，保證了試驗的有效性。（6）

吳環(huán)等人進一步將該方法推廣到嬰幼兒配方乳粉中的其他3種水溶性維生素（葉酸、生物素、肌醇）的測定，結(jié)果同樣有效。（8）

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術研究院王志偉等人對于天然燕麥的維生素B12的測定，加入了1%的 α-淀粉酶溶液，發(fā)現(xiàn)酶解溶液有助于提取維生素B12，降低樣品粘度，更方便測量，因此優(yōu)于現(xiàn)有的標準方法。

以上探討雖然大部分是針對維生素B12,但對于采用微生物法測定的其他水溶性維生素如葉酸等也同樣有效，可以借鑒。

參考文獻：

1) Margaret E. Gregory. The Microbiological Assay of ‘Vitamin B12’in the Milk of Different Animal Species.British Journal of Nutrition, 1954,8(04): 340

2）蔣孟虹、許蘋等. 微生物法測定腸內(nèi)營養(yǎng)粉劑中微量維生素B12 的含量.食品安全質(zhì)量檢測學報. 2016,7(3):893-897

3）張玉杰、呂為群.奶基嬰幼兒食品中維生素B12活性測定微生物分析法.生物技術,1993(6):39-43

4）陳緒華、劉健、江一飛. 不同測定培養(yǎng)基對維生素B12線性的影響. 生物技術世界. 2013(4):47

5）林耀文、佘之蘊，李姣等.微生物法測定含乳飲料中維生素B12含量. 飲料工業(yè).2013,16(4):39-42

6）吳環(huán)、劉冬虹、張慧、聶炎炎、黃宇峰.微生物法快速檢測食品中維生素B12含量的應用研究.中國乳業(yè).2014,(4):42-44

7)王志偉、徐瓊、陳欣欽、曲勤鳳. 天然燕麥中維生素B12的測定中2種微生物法前處理方式的比較.食品安全質(zhì)量檢測學報, 2017,8(1):275-279

8）劉冬虹，吳環(huán)，聶炎炎，黃宇鋒. 優(yōu)化微生物法快速測定嬰幼兒配方乳粉中4種水溶性維生素.華南預防醫(yī)學,2014(6):594-597